El aumento y la resolucion en los microscopios opticos

 

Vimos que hay dos  tipos de lentes: el ocular, en la parte superior del microscopio, más  próximo al ojo del observador, y el objetivo, próximo al preparado. El ocular normalmente tiene un aumento de 10x (la "x" indica "aumento") por lo que amplifica  una imagen 10 veces su tamaño normal. En cuanto a los objetivos, por lo común tienen un aumento que varía entre 4x a 45x.  Lo normal es encontrar tres objetivos de distinto aumento (4x, 10x y 40x) montados sobre  una base giratoria que permite intercambiarlos para aumentar, en forma creciente, el tamaño  de la imagen. Una propiedad importante de los objetivos es que normalmente invierten la  imagen en todo sentido (de derecha a izquierda y de arriba abajo) y, como el ocular no puede reinvertirla, nosotros la observamos completamente al revés.  Esto no es un problema porque ¿quién sabe qué es arriba y qué abajo en una célula? pero conviene tenerlo en cuenta porque cuando movemos el preparado, la imagen se desplaza  ante nuestros ojos en sentido contrario a lo que esperaríamos!!!. La imagen resultante estará ampliada tantas veces como el producto de las lentes con las  que estoy observando, es decir que si utilizo un ocular de 10x y un objetivo de 4x, veré la  imagen cuarenta veces más grande que su tamaño original. Conviene destacar que existen dos tipos de objetivos: los de observación en seco y los  de inmersión. En el primer caso, el aumento varía de 4x a 45x y alcanza con el índice de  refracción del aire (de ahí el nombre "en seco", por el aire!) para que la imagen se forme nítidamente, pero en el segundo caso, al incrementar el aumento (las lentes de inmersión  tienen aumentos de 90x o 100x) es necesario aumentar el índice de refracción entre el  preparado y la lente para lograr la imagen, para esto se utilizan aceites de cedro o sintético y  la lente se "sumerge" en ellos (de ahí el nombre "de inmersión").   Relación entre aumento, diámetro y distancia: Existe una estrecha relación entre el aumento, el diámetro de la lente y la distancia al  preparado. El diámetro de la lente se relaciona de manera inversa con el aumento (a mayor aumento, menor diámetro), esto se debe al campo que debe abarcar cada uno  (al aumentar el tamaño debo reducir el campo, sino la imagen sería terriblemente grande, por ejemplo, desde un avión veo mucha superficie (campo) pero muy pequeña y poco detallada, a medida que me acerco, veo más grande los detalles pero menor superficie). En cuanto a la distancia al preparado, a mayor aumento que quiera conseguir, más cerca debo estar del  preparado y entender esto es fundamental para comprender el porque de las lentes de  inmersión: sin ahondar en cuestiones físicas, llega un momento en que a través del aire no me puedo acercar más, entonces, para poder seguir "acercándome" tengo que modificar las propiedades de refracción del medio. El efecto que logro aumentando el índice de refracción es que, para la luz, el preparado esté más "cerca" del objetivo.   Poder resolutivo y límite de resolución: El poder resolutivo es la capacidad que tiene un microscopio (o el ojo humano, etc.) de  percibir por separado dos puntos pequeños, adyacentes y cercanos. Vale decir, es la  capacidad para percibir detalles. El poder resolutivo aumenta a medida que disminuye la  distancia que separa dichos puntos. Es decir, si dos puntos distan 1cm uno del otro y yo los  veo como un solo punto borroso (aparte de necesitar urgente un oculista) tendré menor poder resolutivo que alguien que los distingue por separado o que distingue perfectamente puntos  que distan de 0,5cm entre si. Si definimos ahora límite de resolución como la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que sean distinguidos por separado, comprenderemos fácilmente la relación inversa que se establece entre poder resolutivo y límite de resolución: cuanto menor sea la distancia que debe separar a dos puntos para que se distingan por separado, mayor será el  poder resolutivo necesario para observarlos. El poder resolutivo del microscopio no guarda relación alguna con el aumento del mismo. Depende principalmente de la apertura numérica de la lente y de la longitud de onda de la luz utilizada. Sin abocarnos demasiado a definir "apertura numérica" podemos decir que es un  valor determinado, entre otras cosas, por el diámetro de la lente.

 

La lupa y el microscopio en el Laboratorio

En este esquema podemos ver los componentes principales de un microscopio monocular de luz visible  y la marcha de los rayos que forman la imagen

Microscopio óptico.Descripción:A) ocular, B) objetivo, C) portaobjeto, D) lentes de la iluminación, E) sujeción del objeto (platina), F) espejo de la iluminación.

 

Como vemos , en este tipo de microscopio la luz debe atravezar el especimen a observar por lo cual este debe ser muy delgado .

A este esquema podemos agregar un Condensador ( ubicado debajo de la platina) , un diafragma y un filtro de color que suelen estar incorporados al condensador..Si la fuente de luz està incorporada al microscopio puede haber un dispositivo que se usa para atenuar la luz de la làmpara de iluminaciòn.La platina tambien puede poseer un sistema de movimientos en las direcciones " x e y" que suele tener un vernier para poder localizar facilmente algun detalle en el especimen.

En la siguiente  imagen vemos un microscopio binocular un poco mas complejo que el anterior  ,puede apreciarse el mecanismo de enfoque ( macro y micrometricos) ,posee control para la distancia interpupilar ( compensa por la diferencia de separacion de los ojos de cada operador )  , portafiltro de luz , diafragma, charriot  en la platina que permite ubicar un punto del preparado con precision, y revolver portaobjetivos ( selecciona facilmente el aumento a emplear).

El microscopio debe esta ubicado sobre una supericie lisa y firme, libre de vibraciones ya que cada movimiento se magnifica por el aumento del mismo.

Algunos microscopios muy simples ó antiguos ( pueden ser excelentes) poseen una fuente externa de luz que se enfoca en un espejo ( suele tener una cara plana y otra concava) situado debajo de la platina.

Tipos de Conectores de los electrodos

Medicion de pH en la Industria -Control de procesos

Soluciones Calibradoras -Standares de referencia

9-Medicion de soluciones con interferentes o en presencia de solventes

Medicion en presencia de alta concentracion de Sodio

El error alcalino se produce por las altas concentraciones de cation Sodio y el error ácido por la alta concentración de aniones

El cation Sodio es el principal interferente al medir soluciones de pH mayor a 10 u 11  ( actividades del ion Hidrógeno muy bajas).y a temperaturas altas.

Cada tipo de vidrio con el que está construido un electrodo exibe una selectividad para los cationes H , Na, K, Li, etc .En el caso del Sodio es  llamada "Interferencia  Alcalina" puede ser muy importante.Por otra parte es posible hacer electrodos que utilizen este fenomeno para medir la concentración de estos iones.

Hay un "coeficiente de selectividad" que esta expresado ( en el caso del Sodio )  como  un cociente
H /Na que se emplea en la "Ecuacion de Nicolsky -Eisenman " que es una extension de la Ecuación de Nernst. 

Como ejemplo del error que puede obtenerse , para una concentracion de Sodio de 0.1Molar , al medir el pH de una Solucion daria en estas condiciones una medida de  pH = 8,96 cuando realmente su pH es de 10  y un valor de pH = 8,70 si el pH real fuese 9.00  suponiendo un coeficiente de selectividad  H⁺/Na⁺ de 10^-8



Existen nomogramas para corregir la interferencia del cation Sodio a elevados valores  de pH .


Medicion en presencia de Tris ( Tris (Hidroxymetil AminoMetano) 

El "Tris"es muy usado en Buffers con usos biológicos y causa interferencias al reaccionar con los iones Ag al igual que las soluciones que contienen proteinas ó sulfuros.En estos casos es conveniente emplear electrodos con doble juntura y limpiarlos frecuentemente.


Mediciones de pH en muestras no acuosas

Estas muestras ( aceites, cosmeticos, acetona, etanol, hidrocarburos , etc) presentan lecturas inestables , la respuesta del electrodo es lenta y ademas causan deshidratacion del bulbo sensible del electrodo ademas de su contaminacion.
En estos casos hay que rehidratar el electrodo frecuentemente y limpiarlo con algun solvente que remueva la muestra grasosa y luego con acetona seguida de un remojo en buffer , ademas conviene reemplazar el liquido del electrodo de referencia por una mezcla en la que intervengan solventes ya que los potenciales de difusion son distintos que en el agua y causan derivas de la lectura.Para reemplazarlas se pueden emplear soluciones saturadas de KI en acetona, LiCl en metanol, mezclas de metanol y agua saturadas con KCl ,Acido Acetico glacial saturado con KI, el Ioduro de Potasio ( KI ) es en general mas soluble que el KI.En estos casos dejar que el electrodo de referencia se equilibre una noche al menos antes de usarlo.

La alta resistencia ( baja conductividad) de muchos solventes orgánicos  causa ruido electrico y respuesta lenta del electrodo.En estos casos se recomienda usar un electrodo con un vidrio de baja resistencia .Tambien ayuda agregar una pequeña cantidad de una sal inerte ( por ejemplo un Amonio Cuaternario) para incrementar la conductividad de la solución.Este agregado  causara un pequeño cambio en la actividad del ion hidrógeno pero sera pequeño comparado con el error que apareceria  en su ausencia.
De todas formas el valor de pH de una solución no acuosa no puede ser comparado con exactitud con un Buffer acuoso.La actividad de los iones Hidrógeno son diferentes debido a la mobilidad iónica, a las constantes dielectricas y a las actividades del solvente.Los valores obtenidos de pH solo pueden ser medidas relativas , comparar las cualidades acido-base de solventes similares  o para indicar cuando se necesitan ajustes de pH.
Mediciones de pH en muestras sólidas y en superficies

Si la muestra es blanda ó semi-blanda se puede usar un electrodo que tiene una forma aguzada y se penetra en la muestra hasta una profundidad constante para todas las medidas ( tener cuidado de que alcance el nivel de la juntura).La superficie de la muestra debe estar mojada, usar un electrodo de punta chata y medir en la superficie.Si es necesario agregar una gota de agua destilada ó de Cloruro de Potasio para mojar la superficie antes de poner el electrodo.A todas las muestras ponerles la misma cantidad para asegurar reproducibilidad.

Si la muestra es soluble en agua ó se dispersa fácilmente , mezclar una cantidad fija de la muestra en una cantidad fija de agua y medir la solución resultante.Se suele usar hasta un 25 % de muestra en peso ó volumen.

Para quesos , picar 5 gramos de queso en 100 ml de agua destilada y agitar bien la mezcla,dejar reposar por 5 minutos para que dse asienten las partículas y medir el Ph de la porcion líquida.

Para papel , empapar 1 gramo de trocitos del papel en agua ddestilada , esperar 10 minutos a que decanten y medir el pH del líquido.

Para muestras de suelo , hacer lo mismo que los casos anteriores.

Mediciones de pH en muestras de agua pura

En las muestras de agua pura, la respuesta del electrodo tiende a desvisarse , es lenta , no es reproducible y es poco precisa.Las mediciones son difíciles debido a la baja conductividad de esa muestra, diferencias entre las muestras de baja fuerza iónica  y los buffers, cambios en los potenciales de la juntura y la absorción de dioxido de carbono por la mezcla.

Ademas, la baja conductividad de la muestra hace que se comporte como una antena y esto introduce ruido electrico.

Cuando se calibran los electrodos con Buffers de alta fuerza iónica, esta diferencia con una muestra de agua pura causara diferencias en la movilidad de los iones de la juntura y esto genera ruido electrico.

Por la misma razon es fácil contaminar la muestra con el electrodo si este acarrea solución de calibración.

Medicion del pH de barros, lodos,suspensiones, coloides,pastas y muestras viscosas

Debido a su naturaleza,  estas muestras pueden obstruir la juntura del electrodo y recubrir la membrana sensible lo que resulta en derivas, ruido electrico y lentas respuestas.Existen electrodos con junturas especiales para estos casos que son resistentes a las obstrucciones.Recordar de sumergir el electrodo hasta la juntura y a la misma profundidad para todas las muestras.

Mediciones de pH en muestras de pH extremos o con alta concentración de sales.

En los casos de medir soluciones con pHs  menores a 2 ó mayores a 12 y con concentracion de sales mayores a 0,1 Molar  ( Acido de baterias,Baños de cobreado, salmueras, etc) surgen problemas debido a los potenciales de union líquida del electrodo de referencia.Debido a la diferente composicion de la solución y el liquido de llenado del electrodo.Esto causa deriva de la medida y respuesta lenta.

Hay electrodos especiales para estos casos pero lo que se puede hacer es agregar al electrodo de referencia una base diluida en el caso de pHs mayores a 12 o un acido diluido para pHs menores a 2.Cuando se trata de medir Soluciones de alta concentracion salina se recomienda llenar el electrodo de referencia con una solución fuerte de la misma sal que se medira.

Ejemplo , al medir soluciones de Bromuro de Sodio, llenar el electrodo de referencia con unsa Solución de Bromuro de Sodio. 

8-Metodo recomendado para calibrar un electrodo de vidrio

Como recomendacion , controlar que si se trata de electrodos recargables este con suficiente cantidad de esta como para que el nivel este al menos 2,5 centimetros por sobre la superficie de la solucion o buffer a medir.Entre las mediciones lavar el electrodo con agua destilada y secar ( sin frotar) con una tela sin pelusa.Emplear un recipiente limpio y un agitador magnetico a una velocidad moderada y uniforme.Puede ser necesario interponer un aislante entre el recipiente y el agitador para que este no caliente la solución.No poner el electrodo en contacto ni con el fondo ni con las paredes del recipiente.
Los Buffers para calibración deben utilizarse en porciones de un solo uso.Elegir 3 valores, uno que esé cercano al Isopotencial ( pH 7.00) otros 2 que sean cercanos al del valor del pH de la solucion con la que se va a emplear el electrodo ya calibrado y que esten de una a cuatro Unidades de pH aparte.Por ejemplo pH 4.01 y pH 10.01
Los Buffers de calibración deben estar a la misma temperatura que la muestra a medir.En caso de que no sea asi, habra que "compensar" la temperatura.
Si se trata de un electrodo con electrolito recargable destapar el agujero de carga.

Tener en cuenta que el control de "compensacion de Temperatura" corrige la variacion de respuesta de ese electrodo con la Temperatura pero no compensa el cambio que sufre el pH de las soluciones con la misma.

a) En 3 vasos de precipitados de 50 ml poner 30 mL de cada Buffer.

b) Lavar el electrodoy secarlo como se explico ante

c)Sumergir el electrodo y agitar como se recomendó.

d) Espera a que se estabilize la medida .En este paso puede ser necesario introducir el valor de pH del Buffer de Calibracion ( el pH de  su temperatura de medición) ó puede ser que sea un Instrumento que reconoce automaticamente el valor del mismo.Registrar el valor en miliVoltios.

e)  Lavar el electrodo como se dijo ante

f) Sumergir el electrodo en el siguiente Buffer como se explico en "c" y "d".Repertir lo hecho en "d".Registrar el valor en miliVoltios.
g)Repetir las operaciones con el tercer Buffer .Registrar el valor en miliVoltios.

h) A partir de las medidas de miliVoltios obtenidas para los distintos pH , calcular el valor de la pendiente del electrodo.Recordar que debe estar en un valor del 92 % al 102 % del valor teórico, es decir debe tener una respuesta de entre 54 y 60 miliVoltios por Unidad de pH.Este dato servira para controlar el envejecimiento natural del electrodo y adelantarse al final de su vida útil.





Arriba vemos una Tabla con los valores de pH que poseen los Buffers de referencia aceptados a varias temperaturas.Se puede comprobar que el efecto delaumento de Temperatura sobre el pH es más notable para los buffers de características alcalinas.

El error que se comete al no tener en cuenta el cambio de la pendiente con la temperatura de la medición ( solo teniendo en cuenta la contribucion del electrodo de vidrio a ella) se puede calcular a partir de    0,003 x Unidades de pH x Diferencia de temperatura

Por ejemplo Supongamos que se calibro un electrodo de vidrio con un Buffer de pH =7.00 a 25 °C y luego se mide una muestra cuyo pH es de 4 pero la medicion se hace a 23 °C

0,003 U pH / UpH / °C  x 3 x 2 = 0,018 Unidades pH

La medicion entregaria  entonces un pH de 4.00 + 0,018  = 4.02 aproximadamente

En el caso que se midiera a una temperatura de 75 °C esa misma solucion de pH 4,00 acusaria una lectura con mucho mayor error
  0,003 x 3x 52 = 0,45   entonces 4,00 +0,45 = 4,45